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最新对不同生长阶段大蒜鳞茎成分的代谢组学分析方法与流程

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泰宁新闻网 http://www.tainingxinwen.cn 2020-10-17 22:22 出处:网络
这里写的最新对不同生长阶段大蒜鳞茎成分的代谢组学分析方法与流程,小编为您一一讲解!

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本发明涉及检测分析技术领域,且特别涉及对不同生长阶段大蒜鳞茎成分的代谢组学分析方法。



背景技术:

大蒜(拉丁名:alliumsativuml.)是世界上重要的药食同源植物之一,具有抗菌、防癌抗癌、预防和治疗心血管疾病、抗氧化等重要的生理功能。大蒜中不仅含有蒜氨酸等功能性成分,还含有丰富的氨基酸、多酚、维生素等营养成分。大蒜鳞茎在整个生长过程中均有食用价值,且其营养品质成分在不同生长期差异较大,进而不同阶段的大蒜可能会有不同的应用价值。但是,现有的检测方法不能直观的反应各代谢物在不同生长阶段的变化情况,无法对不同生长阶段的大蒜应用提供指导。

鉴于此,提出本申请。



技术实现要素:

本发明的目的在于提供一种对不同生长阶段大蒜鳞茎成分的代谢组学分析方法,其能够对不同生长阶段的大蒜鳞茎进行成分的分析,准确地找出不同生长期大蒜鳞茎中的差异代谢产物。

本发明解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。

本发明提出了一种对不同生长阶段大蒜鳞茎成分的代谢组学分析方法,包括如下步骤:将不同生长阶段的大蒜鳞茎样品进行化学成分非靶向代谢组学分析,对采集到的数据进行处理筛选出差异代谢物,对得到的差异代谢物进行鉴别和确证,并分析差异代谢物在不同生长阶段的变化规律。

本发明实施例提供一种对不同生长阶段大蒜鳞茎成分的代谢组学分析方法的有益效果是:其通过将不同生长阶段的大蒜鳞茎样品进行化学成分非靶向代谢组学分析,对采集到的数据进行处理进而筛选出差异代谢物,然后对得到的差异代谢物进行鉴别和确证进而确定差异代谢物,并分析差异代谢物在不同生长阶段的变化规律。能够快速准确地找出不同生长期大蒜鳞茎中的差异代谢产物,一方面可了解代谢物在鳞茎中的累积规律,另一方面可根据不同的消费、加工等需求选择不同生长阶段的大蒜鳞茎,从而为大蒜的合理消费及适时采收提供依据。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案,下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍,应当理解,以下附图仅示出了本发明的某些实施例,因此不应被看作是对范围的限定,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为不同生长期大蒜鳞茎上调和下调代谢物数量统计图;

图2为不同生长期大蒜鳞茎和qc样本的pca得分图(a);

图3为不同生长期大蒜鳞茎和qc样本的载荷图(b);

图4为不同生长期大蒜鳞茎差异代谢物层次聚类热图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚,下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者,按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市售购买获得的常规产品。

下面对本发明实施例提供的一种对不同生长阶段大蒜鳞茎成分的代谢组学分析方法进行具体说明。

本发明实施例提供了一种对不同生长阶段大蒜鳞茎成分的代谢组学分析方法,包括如下步骤:将不同生长阶段的大蒜鳞茎样品进行化学成分非靶向代谢组学分析,对采集到的数据进行预处理筛选出差异代谢物,对得到的所述差异代谢物进行鉴别和确证,并分析所述差异代谢物在不同生长阶段的变化规律。

发明人创造性地进行不同生长阶段大蒜鳞茎差异代谢物的筛选和分析,一方面可了解代谢物在鳞茎中的累积规律,另一方面可根据不同的消费、加工等需求选择不同生长阶段的大蒜鳞茎,从而为大蒜的合理消费及适时采收提供依据。

本发明实施例提供的分析方法具体包括如下步骤:

s1、样品制备

大蒜鳞茎样品的制备过程包括:将采集到的不同生长阶段的大蒜鳞茎剥皮,经过冷冻干燥后进行粉碎得到大蒜粉末,对大蒜粉末进行提取得到大蒜提取液以更便于进行代谢物的分离和定性分析。

其中,不同生长阶段的大蒜鳞茎样品的采集过程包括:自大蒜鳞芽开始发育时开始采样,每隔1周采样1次,直至大蒜正常采收后的两周终止采样。

优选地,冷冻干燥过程是在-80~-60℃下干燥48h以上,在较低温度下进行干燥能够充分保持代谢物,以免代谢物进行流失,影响分析的准确性。粉碎过程是将冷冻干燥后的大蒜鳞茎粉碎至50-70目,以更好地进行有效成分的提取。

进一步地,大蒜提取液的制备包括:将大蒜粉末与提取剂混合后进行超声处理再经过离心分离取上清液;提取剂是由甲酸、甲醇和水混合而得,其中,甲酸的质量分数为0.08-0.12%,甲醇和水的体积比为2-4:1;100mg大蒜粉末对应提取剂的体积为7-8ml。发明人对大蒜粉末与提取剂的配比进行了调整,以更充分地将大蒜中的代谢物进行提取,若大蒜粉末与提取剂的配比过大或过小均会影响代谢物的提取种类和提取量。

优选地,超声处理过程是在20-30℃的温度条件下超声10-20min;离心分离过程是在3-5℃、8000-12000rpm条件下,离心3-8min;以提取体系更好地分层,分离得到上清液。

在一些优选的实施例中,大蒜提取液的制备还包括:将上清液经0.1-0.3μm的有机滤膜进行过滤,以去除混杂地有机溶剂等杂质。取等量的上清液作为质量控制样品,以提升整体分析方法的准确性。

s2、非靶向代谢组学分析

非靶向代谢组学分析的过程中采用高效液相色谱进行组分分离,并应用质谱进行分析。

其中,色谱条件包括:色谱柱温度为35-45℃,进样流速为0.2-0.4μl/min,进样体积为1.5-2.5μl;流动相包括第一流动相和第二流动相,第一流动相为甲酸和甲酸铵形成的水溶液,且甲酸的质量分数为0.1-0.2%,甲酸铵的浓度为8-12mm,第二流动相为质量分数为0.1-0.2%的甲酸乙腈溶液;梯度洗脱过程是采用第一流动相和第二流动相配比逐渐变化进行洗脱,在0-8min,第二流动相的质量分数从90%逐渐下降为80%;在8-13min,第二流动相的质量分数从80%逐渐下降为70%;在13-16min,第二流动相的质量分数从70%逐渐下降为60%;在16-16.1min,第二流动相的质量分数从60%逐渐增加为90%;最后,在流动相中第二流动相质量分数为90%平衡3.5-4.5min。

需要说明的是,发明人进一步优化了色谱条件,以使代谢物更好地进行分离,特别是流动相的选择和洗脱梯度的控制,进一步提升代谢物的分离效果。在一些优选的实施例中,色谱柱为amide柱,发明人发现选择该中色谱柱能够更好地分离代谢物。

其中,质谱条件包括:分辨率为65000-75000fwhm,喷雾电压2.5-3.5kv,鞘气压力25-35psi,辅助气8-12arb,毛细管温度为300-350℃,辅助气温度为320-380℃;更优选地,质谱扫描模式为fullms-dd/ms2,fullms对应的扫描范围70-1050m/z;dd/ms2对应的分辨率为17000-18000,nce设定为25-35ev。质谱条件的控制能够进一步提升分析的准确度,为更好地筛选出差异代谢产物奠定基础。

s3、筛选差异代谢物

筛选差异代谢物是将采集得到的不同生长期大蒜鳞茎原始数据进行峰对齐、峰提取、降噪和归一化处理,并通过log2foldchange和p值筛选出每两个相邻生长阶段差异代谢物。差异代谢物是指该代谢物在不同生长期大蒜鳞茎中含量相差较大。每两个相邻生长阶段的差异代谢物的筛选条件为∣log2foldchange∣>1且p<0.05。

优选地,统计每个生长阶段上调和下调差异代谢物的数量,通过柱状图展示代谢物的变化情况,以更加清晰地展现差异代谢物的变化。

采用compounddiscover软件进行峰对齐、峰提取、降噪、归一化处理,compounddiscover软件进行数据处理过程中各参数的设置如下:峰对齐保留时间偏差为1.5-2.5min,化合物检测质量偏差为4-6ppm,最大未知元素组成设定为c90、h190、br3、cl4、k2、n10、na2、o15、p3和s5,最小未知元素组成设定为c和h,最小峰强度设置为450000-550000,信噪比(s/n)阈值为2.5-3.5,一级质谱图匹配的质量偏差为4.5-5.5ppm。

具体地,一级质谱图匹配中所采用的数据库选自chebi、chembank、foodb、massbank、plantcyc、naturechemistry和naturechemistrybiology中的任意一种。

s4、差异代谢物的鉴别和确证

差异代谢物进行鉴别和确证是与二级质谱图进行匹配,并对具有标准品的化合物进行确证;二级质谱图的数据库选自mzcloud或mona;优选地,与二级质谱图与mzcloud数据库进行匹配的得分大于75分。通过二级质谱图的匹配进一步提升差异代谢物检测的准确度,提升整体分析方法的准确率。

s5、差异代谢物的变化规律分析

分析差异代谢物在不同生长阶段的变化规律包括:将差异代谢物的数据导出进行pca分析,通过pca得分图反映不同生长期大蒜鳞茎差异情况,通过pca载荷图分析不同成分含量水平差异及相关性。进行pca分析是将差异代谢物的数据由compounddiscover软件导出至excel进行数据处理后,将不同生长阶段大蒜鳞茎及质量控制样本的峰面积矩阵导入simca-p14.1软件处理。

在一些优选的实施例中,分析差异代谢物在不同生长阶段的变化规律还包括将数据导入mev软件进行层次聚类热图分析,分析每个代谢物在生长过程中的变化规律及其相似性。

需要补充的是,本发明实施例中所限定的具体软件仅为优选实施例,在其他实施例中也可以采用本发明实施例所限定之外的其他软件进行分析。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

本实施例提供一种对不同生长阶段大蒜鳞茎成分的代谢组学分析方法,包括如下步骤:

本实例中大蒜品种为徐蒜917,生长于江苏省徐州市的江苏省农业科学院试验田(n34°16′45.26″,e117°17′27.29″),于2018年10月播种,2019年5月采收。自大蒜鳞芽开始发育时开始采样,每隔1周采样1次,直至大蒜正常采收后的两周终止采样。样品采集时间分别为2019年4月18日(week-1)、4月25日(week-2)、5月2日(week-3)、5月9日(week-4)、5月16日(week-5)、5月23日(week-6)、5月30日(week-7)。所有样品采集均设置3个重复,每个重复每个生长阶段至少采集20个大蒜鳞茎。

(1)样品制备:将大蒜鳞茎剥皮后,每个重复取约300g未损坏的大蒜鳞芽于-70℃进行冷冻干燥。大蒜冷冻干燥完成后,采用平行研磨仪行粉碎,过60目筛后于-80℃冰箱中保存待测。称取200mg冻干大蒜粉末样品置于50ml离心管中,加入15ml含0.1%甲酸的甲醇/水(75/25,v/v)溶液,并涡旋1min使其与样品充分混合;将混合物于25℃条件下超声15min,然后用低温离心机在4℃条件下10000rpm离心5min;取1ml上清液,过0.2μm有机滤膜于2ml进样小瓶中,即得大蒜提取液。分别从各样品溶液中取等量溶液,混匀,置于液相小瓶中作为质量控制(qualitycontrol,qc)样品。

(2)非靶向代谢组学分析:采用thermofisheru3000超高效液相色谱仪,色谱柱为amide柱(2.1×150mm,3.5μm),柱温40℃,进样流速为0.3μl/min,进样体积为2μl,流动相为0.15%甲酸和10mm甲酸铵水溶液(第一流动相a)和0.15%甲酸乙腈溶液(第二流动相b),梯度洗脱流程为:0–8min,90–80%b;8–13min,80–70%b;13–16min,70–60%b;16–16.1min,60–90%b;最后,采用90%b平衡3.9min,共20min。

质谱条件:thermoscientifictmqexactivetmorbitrap质谱仪,采用电喷雾电离(esi)源,于正、负模式下分别扫描。各参数设置如下:分辨率70000(fwhm);喷雾电压3.00kv;鞘气压力30psi;辅助气10arb;毛细管温度320℃;辅助气温度350℃;质谱扫描模式fullms-dd/ms2,fullscan的扫描范围70~1050m/z;dd/ms2:分辨率17500,nce30ev。

(3)筛选差异代谢物:使用compounddiscover3.1软件对步骤色谱和质谱所得检测数据进行预处理,包括峰对齐、峰提取、降噪、归一化处理、化合物鉴别;在compounddiscover3.1数据处理过程中各参数设置如下:峰对齐保留时间偏差为2min;化合物检测质量偏差为5ppm,最大未知元素组成设定为c90、h190、br3、cl4、k2、n10、na2、o15、p3、s5,最小未知元素组成设定为c、h,最小峰强度设置为500000,信噪比(s/n)阈值设为3;searchchemspider中选择chebi、chembank、foodb、massbank、plantcyc、naturechemistry、naturechemistrybiology数据库进行一级质谱图的匹配,质量偏差为5ppm。通过compounddiscover3.1软件内置的数据统计功能筛选差异代谢物,筛选条件为:∣log2foldchange∣>1,且p<0.05。根据上述条件统计每个生长阶段上调和下调的代谢物数量,并用origin9.1生成柱状图1。

从图1可以看出,大蒜鳞茎在第1周到第2周之间代谢物含量水平变化较大,且上调化合物数量多于下调化合物,随后差异代谢物数量降低。第5周为当地大蒜采收时间,在第5周到第6周之间,下调化合物相对较多,在第6周到第7周代谢物变化较小。

(4)差异代谢物的鉴别和确证:将步骤(3)筛选得到的差异代谢物进一步同mzcloud、mona等数据库中的二级质谱图进行匹配。其中,采用mzcloud匹配的二级质谱图得分均大于75分,有23个化合物最终采用标准品确证,最终共鉴定得到42个化合物,其详细信息如表1所示。

表1基于uhplcq-exactiveorbitrapms技术鉴定的42个化合物信息

注:*保留时间及二级质谱图通过标品确证☆二级质谱图通过mzcloud数据库确认;★二级质谱图通过mona数据库确认;其他未标注化合物通过质谱解析确认。

鉴定的42个差异代谢物,为7个含硫化合物、26个氨基酸及其衍生物、5个核苷酸及其衍生物、2个糖类化合物和2个其它化合物。其中,23个化合物通过标准品确证。

(5)差异代谢物的变化规律分析

将步骤(4)得到的差异代谢物的峰面积等数据由compounddiscover3.1导出至excel,预处理后将7个不同生长阶段大蒜鳞茎及qc样本(均为3个重复)的峰面积矩阵导入simca-p14.1软件,进行pca分析,了解不同生长期大蒜鳞茎总体差异。

如图2所示,qc样本紧密的聚集在一起,说明实验期间该仪器精密度良好。pca模型的r2x=0.951,q2=0.890,表明该模型拟合能力较好,预测能力较强。从pca得分图(图2)可以看出,前5周大蒜鳞茎可以明显区分开,各自聚为一类,说明采收前不同阶段的大蒜鳞茎化学差异较为明显,且第1周大蒜鳞茎与其它时期差异最为显著;第6周和第7周大蒜鳞茎差异较小。通过pca载荷图(图3)可以看出,除arginine、alanine外的大部分氨基酸在大蒜鳞茎发育初期含量较高,而含“γ-glutamyl-”的二肽类化合物在大蒜生长后期含量较高;从pca载荷图还可以看出各化合物的相关性,如arginine为大蒜中20中常见游离氨基酸中含量最高的氨基酸,在大蒜鳞茎生长发育过程中与其他大部分游离氨基酸含量变化水平呈反相关。

(6)mev层次聚类热图分析

将步骤(5)中得到的42个差异代谢物的数据矩阵预处理后导入mev软件进行层次聚类热图分析(图4)。图4中每一纵列表示一个大蒜鳞茎生长期样本,每个像素点代表一个代谢物。像素点颜色表示代谢物相对含量的高低,颜色由浅到深表示含量由低到高。层次聚类分析表明,前3周大蒜鳞茎聚为一类,后4周聚为一类,说明以第3周和第4周为界,大蒜鳞茎中该42种化合物之间存在明显差异。

图4显示,在7个存在差异的含硫化合物中,s-(trans-1-propenyl)-l-cysteine和s-allyl-l-cysteine在大蒜鳞茎生长初期(前3周)含量相对较高,在第3周以后,γ-l-glutamyl-s-allyl-l-cysteine、γ-l-glutamyl-s-methyl-l-cysteine、γ-l-glutamyl-s-(trans-1-propenyl)-l-cysteine、γ-glutamyl-s-allylthio-l-cysteine和γ-glutamyl-s-(1-propenyl)-l-cysteinesulfoxide的含量呈上升趋势。大部分常见游离氨基酸在生长前3周含量较高,包括threonine、tryptophan、tyrosine、valine、isoleucine、phenylalanine、leucine和asparticacid等,而大部分二肽类化合物在大蒜后4周含量较高,包括γ-glutamylphenylalanine、l-γ-glutamyl-l-leucine、γ-glutamyl-l-valine、γ-glutamyltyrosine和γ-glutamylmethionine等。

实施例2

本实施例提供一种对不同生长阶段大蒜鳞茎成分的代谢组学分析方法,其与实施例1的具体步骤相同,区别仅在于参数的控制:

(1)样品制备:将大蒜鳞茎剥皮后,每个重复取约300g未损坏的大蒜鳞芽于-80℃进行冷冻干燥。大蒜冷冻干燥完成后,采用平行研磨仪行粉碎,过60目筛后于-80℃冰箱中保存待测。称取200mg冻干大蒜粉末样品置于50ml离心管中,加入14ml含0.08%甲酸的甲醇/水(50/25,v/v)溶液,并涡旋1min使其与样品充分混合;将混合物于20℃条件下超声10min,然后用低温离心机在3℃条件下8000rpm离心3min;取1ml上清液,过0.1μm有机滤膜于2ml进样小瓶中,即得大蒜提取液。分别从各样品溶液中取等量溶液,混匀,置于液相小瓶中作为质量控制(qualitycontrol,qc)样品。

(2)非靶向代谢组学分析:采用thermofisheru3000超高效液相色谱仪,色谱柱为amide柱(2.1×150mm,3.5μm),柱温35℃,进样流速为0.2μl/min,进样体积为1.5μl,流动相为0.1%甲酸和8mm甲酸铵水溶液(第一流动相a)和0.1%甲酸乙腈溶液(第二流动相b),梯度洗脱流程为:0–8min,90–80%b;8–13min,80–70%b;13–16min,70–60%b;16–16.1min,60–90%b;最后,采用90%b平衡3.5min。

质谱条件:thermoscientifictmqexactivetmorbitrap质谱仪,采用电喷雾电离(esi)源,于正、负模式下分别扫描。各参数设置如下:分辨率65000(fwhm);喷雾电压2.5kv;鞘气压力25psi;辅助气8arb;毛细管温度300℃;辅助气温度320℃;质谱扫描模式fullms-dd/ms2,fullscan的扫描范围70~1050m/z;dd/ms2:分辨率17500,nce25ev。

筛选差异代谢物:使用compounddiscover3.1软件对步骤色谱和质谱所得检测数据进行预处理,包括峰对齐、峰提取、降噪、归一化处理、化合物鉴别;在compounddiscover3.1数据处理过程中各参数设置如下:峰对齐保留时间偏差为1.5min;化合物检测质量偏差为4ppm,最大未知元素组成设定为c90、h190、br3、cl4、k2、n10、na2、o15、p3、s5,最小未知元素组成设定为c、h,最小峰强度设置为500000,信噪比(s/n)阈值设为2.5;searchchemspider中选择chebi、chembank、foodb、massbank、plantcyc、naturechemistry、naturechemistrybiology数据库进行一级质谱图的匹配,质量偏差为4.5ppm。通过compounddiscover3.1软件内置的数据统计功能筛选差异代谢物,筛选条件为:∣log2foldchange∣>1,且p<0.05。根据上述条件统计每个生长阶段上调和下调的代谢物数量,并用origin9.1生成柱状图。

实施例3

本实施例提供一种对不同生长阶段大蒜鳞茎成分的代谢组学分析方法,其与实施例1的具体步骤相同,区别仅在于参数的控制:

(1)样品制备:将大蒜鳞茎剥皮后,每个重复取约300g未损坏的大蒜鳞芽于-60℃进行冷冻干燥。大蒜冷冻干燥完成后,采用平行研磨仪行粉碎,过60目筛后于-80℃冰箱中保存待测。称取200mg冻干大蒜粉末样品置于50ml离心管中,加入16ml含0.12%甲酸的甲醇/水(100/25,v/v)溶液,并涡旋1min使其与样品充分混合;将混合物于30℃条件下超声20min,然后用低温离心机在5℃条件下12000rpm离心8min;取1ml上清液,过0.3μm有机滤膜于2ml进样小瓶中,即得大蒜提取液。分别从各样品溶液中取等量溶液,混匀,置于液相小瓶中作为质量控制(qualitycontrol,qc)样品。

(2)非靶向代谢组学分析:采用thermofisheru3000超高效液相色谱仪,色谱柱为amide柱(2.1×150mm,3.5μm),柱温45℃,进样流速为0.4μl/min,进样体积为2.5μl,流动相为0.2%甲酸和12mm甲酸铵水溶液(第一流动相a)和0.2%甲酸乙腈溶液(第二流动相b),梯度洗脱流程为:0–8min,90–80%b;8–13min,80–70%b;13–16min,70–60%b;16–16.1min,60–90%b;最后,采用90%b平衡4.5min。

质谱条件:thermoscientifictmqexactivetmorbitrap质谱仪,采用电喷雾电离(esi)源,于正、负模式下分别扫描。各参数设置如下:分辨率75000(fwhm);喷雾电压3.5kv;鞘气压力35psi;辅助气12arb;毛细管温度350℃;辅助气温度380℃;质谱扫描模式fullms-dd/ms2,fullscan的扫描范围70~1050m/z;dd/ms2:分辨率18000,nce25ev。

筛选差异代谢物:使用compounddiscover3.1软件对步骤色谱和质谱所得检测数据进行预处理,包括峰对齐、峰提取、降噪、归一化处理、化合物鉴别;在compounddiscover3.1数据处理过程中各参数设置如下:峰对齐保留时间偏差为2.5min;化合物检测质量偏差为6ppm,最大未知元素组成设定为c90、h190、br3、cl4、k2、n10、na2、o15、p3、s5,最小未知元素组成设定为c、h,最小峰强度设置为500000,信噪比(s/n)阈值设为3.5;searchchemspider中选择chebi、chembank、foodb、massbank、plantcyc、naturechemistry、naturechemistrybiology数据库进行一级质谱图的匹配,质量偏差为5.5ppm。通过compounddiscover3.1软件内置的数据统计功能筛选差异代谢物,筛选条件为:∣log2foldchange∣>1,且p<0.05。根据上述条件统计每个生长阶段上调和下调的代谢物数量,并用origin9.1生成柱状图。

实施例4

本实施例提供一种对不同生长阶段大蒜鳞茎成分的代谢组学分析方法,其与实施例1的具体步骤相同,区别仅在于:色谱柱为c18柱。

实施例5

本实施例提供一种对不同生长阶段大蒜鳞茎成分的代谢组学分析方法,其与实施例1的具体步骤相同,区别仅在于:冻干大蒜粉末与提取液的用量比不同,具体地,取200mg冻干大蒜粉末样品置于50ml离心管中,加入12ml含0.1%甲酸的甲醇/水(75/25,v/v)溶液。

实施例6

本实施例提供一种对不同生长阶段大蒜鳞茎成分的代谢组学分析方法,其与实施例1的具体步骤相同,区别仅在于:冻干大蒜粉末与提取液的用量比不同,具体地,取200mg冻干大蒜粉末样品置于50ml离心管中,加入20ml含0.1%甲酸的甲醇/水(75/25,v/v)溶液。

试验例1

实施例4中化合物的分离度较差。实施例5中因部分化合物浓度过高,而使组间的差异性变小;实施例6中因部分化合物浓度过低,而低于检出限。实施例5和6均会使差异代谢物数量减少。

综上所述,本发明提供的对不同生长阶段大蒜鳞茎成分的代谢组学分析方法,其通过将不同生长阶段的大蒜鳞茎样品进行化学成分非靶向代谢组学分析,对采集到的数据进行预处理进而筛选出差异代谢物,然后对得到的差异代谢物进行鉴别和确证进而确定差异代谢物,并分析差异代谢物在不同生长阶段的变化规律。能够快速准确地找出不同生长期大蒜鳞茎中的差异代谢产物,一方面可了解代谢物在鳞茎中的累积规律,另一方面可根据不同的消费、加工等需求选择不同生长阶段的大蒜鳞茎,从而为大蒜的合理消费及适时采收提供依据。

以上所描述的实施例是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围,而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。


技术特征:

1.一种对不同生长阶段大蒜鳞茎成分的代谢组学分析方法,其特征在于,包括如下步骤:

将不同生长阶段的大蒜鳞茎样品进行化学成分非靶向代谢组学分析,对采集到的数据进行处理筛选出差异代谢物,对得到的所述差异代谢物进行鉴别和确证,并分析所述差异代谢物在不同生长阶段的变化规律。

2.根据权利要求1所述的对不同生长阶段大蒜鳞茎成分的代谢组学分析方法,其特征在于,所述大蒜鳞茎样品的制备过程包括:将采集到的不同生长阶段的大蒜鳞茎剥皮,经过冷冻干燥后进行粉碎得到大蒜粉末,对所述大蒜粉末进行提取得到大蒜提取液;

优选地,冷冻干燥过程是在-80~-60℃下干燥48h以上;

优选地,粉碎过程是将冷冻干燥后的大蒜鳞茎粉碎至50-70目;

优选地,不同生长阶段的所述大蒜鳞茎样品的采集过程包括:自大蒜鳞芽开始发育时开始采样,每隔1周采样1次,直至大蒜正常采收后的两周终止采样。

3.根据权利要求2所述的对不同生长阶段大蒜鳞茎成分的代谢组学分析方法,其特征在于,所述大蒜提取液的制备包括:将所述大蒜粉末与提取剂混合后进行超声处理再经过离心分离取上清液;

优选地,所述提取剂是由甲酸、甲醇和水混合而得,其中,甲酸的质量分数为0.08-0.12%,甲醇和水的体积比为2-4:1;

优选地,100mg所述大蒜粉末对应所述提取剂的体积为7-8ml;

优选地,超声处理过程是在20-30℃的温度条件下超声10-20min;

优选地,离心分离过程是在3-5℃、8000-12000rpm条件下,离心3-8min;

优选地,所述大蒜提取液的制备还包括:将所述上清液经0.1-0.3μm的有机滤膜进行过滤;

优选地,所述大蒜提取液的制备还包括:取等量的所述上清液作为质量控制样品。

4.根据权利要求1所述的对不同生长阶段大蒜鳞茎成分的代谢组学分析方法,其特征在于,所述非靶向代谢组学分析的过程中采用高效液相色谱进行组分分离,并应用质谱进行分析;

优选地,色谱条件包括:色谱柱温度为35-45℃,进样流速为0.2-0.4μl/min,进样体积为1.5-2.5μl;流动相包括第一流动相和第二流动相,所述第一流动相为甲酸和甲酸铵形成的水溶液,且甲酸的质量分数为0.1-0.2%,甲酸铵的浓度为8-12mm,所述第二流动相为质量分数为0.1-0.2%的甲酸乙腈溶液;

优选地,梯度洗脱过程是采用所述第一流动相和所述第二流动相配比逐渐变化进行洗脱,在0-8min,所述第二流动相的质量分数从90%逐渐下降为80%;在8-13min,所述第二流动相的质量分数从80%逐渐下降为70%;在13-16min,所述第二流动相的质量分数从70%逐渐下降为60%;在16-16.1min,所述第二流动相的质量分数从60%逐渐增加为90%;最后,在流动相中所述第二流动相质量分数为90%平衡3.5-4.5min;

更优选地,所述色谱柱为amide柱。

5.根据权利要求4所述的对不同生长阶段大蒜鳞茎成分的代谢组学分析方法,其特征在于,质谱条件包括:分辨率为65000-75000fwhm,喷雾电压2.5-3.5kv,鞘气压力25-35psi,辅助气8-12arb,毛细管温度为300-350℃,辅助气温度为320-380℃;更优选地,质谱扫描模式为fullms-dd/ms2,fullms对应的扫描范围70-1050m/z;dd/ms2对应的分辨率为17000-18000,nce设定为25-35ev。

6.根据权利要求1所述的对不同生长阶段大蒜鳞茎成分的代谢组学分析方法,其特征在于,筛选所述差异代谢物是将采集得到的不同生长期大蒜鳞茎原始数据进行峰对齐、峰提取、降噪和归一化处理,并通过log2foldchange和p值筛选出每两个相邻生长阶段差异代谢物;

优选地,统计每个生长阶段上调和下调差异代谢物的数量,通过柱状图展示代谢物的变化情况;

优选地,每两个相邻生长阶段的所述差异代谢物的筛选条件为∣log2foldchange∣>1且p<0.05。

7.根据权利要求6所述的对不同生长阶段大蒜鳞茎成分的代谢组学分析方法,其特征在于,采用compounddiscover软件进行峰对齐、峰提取、降噪、归一化处理;

优选地,所述compounddiscover软件进行数据处理过程中各参数的设置如下:峰对齐保留时间偏差为1.5-2.5min,化合物检测质量偏差为4-6ppm,最大未知元素组成设定为c90、h190、br3、cl4、k2、n10、na2、o15、p3和s5,最小未知元素组成设定为c和h,最小峰强度设置为450000-550000,信噪比(s/n)阈值为2.5-3.5,一级质谱图匹配的质量偏差为4.5-5.5ppm;

更优选地,一级质谱图匹配中所采用的数据库选自chebi、chembank、foodb、massbank、plantcyc、naturechemistry和naturechemistrybiology中的至少一种。

8.根据权利要求1所述的对不同生长阶段大蒜鳞茎成分的代谢组学分析方法,其特征在于,所述差异代谢物进行鉴别和确证是与二级质谱图进行匹配,并对具有标准品的化合物进行确证;

优选地,所述二级质谱图的数据库选自mzcloud或mona;

优选地,与所述二级质谱图与mzcloud数据库进行匹配的得分大于75分。

9.根据权利要求1所述的对不同生长阶段大蒜鳞茎成分的代谢组学分析方法,其特征在于,分析所述差异代谢物在不同生长阶段的变化规律包括:将所述差异代谢物的数据导出进行pca分析,通过pca得分图反映不同生长期大蒜鳞茎差异情况,通过pca载荷图分析不同成分含量水平差异及相关性;

优选地,进行pca分析是将所述差异代谢物的数据由compounddiscover软件导出至excel进行数据处理后,将不同生长阶段大蒜鳞茎及质量控制样本的峰面积矩阵导入simca-p14.1软件处理。

10.根据权利要求9所述的对不同生长阶段大蒜鳞茎成分的代谢组学分析方法,其特征在于,分析所述差异代谢物在不同生长阶段的变化规律还包括将数据导入mev软件进行层次聚类热图分析,分析每个代谢物在生长过程中的变化规律及其相似性。

技术总结
本发明公开了对不同生长阶段大蒜鳞茎成分的代谢组学分析方法,涉及检测分析技术领域。对不同生长阶段大蒜鳞茎成分的代谢组学分析方法包括:将不同生长阶段的大蒜鳞茎样品进行化学成分非靶向代谢组学分析,对采集到的数据进行处理筛选出差异代谢物,对得到的差异代谢物进行鉴别和确证,并分析差异代谢物在不同生长阶段的变化规律。能够快速准确地找出不同生长期大蒜鳞茎中的差异代谢产物,一方面可了解代谢物在鳞茎中的累积规律,另一方面可根据不同的消费、加工等需求选择不同生长阶段的大蒜鳞茎,从而为大蒜的合理消费及适时采收提供依据。

技术研发人员:邱静;刘平香;钱永忠
受保护的技术使用者:中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所
技术研发日:2020.04.21
技术公布日:2020.06.26

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