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推荐一种用于超分辨成像的脂滴荧光染料及其合成和生物应用的制作方法

泰宁新闻网 http://www.tainingxinwen.cn 2020-10-18 01:04 出处:网络
如下提供的推荐一种用于超分辨成像的脂滴荧光染料及其合成和生物应用的制作方法,小编带大家了解一下 。

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本发明属于超分辨成像与脂滴荧光染料领域,具体涉及一种用于超分辨成像的脂滴荧光染料及其合成和生物应用。



背景技术:

长期以来,脂滴一直被认为是一种类似糖原的颗粒,仅用于存储能量,为一种惰性的细胞内含物。因此脂滴在很长一段时间并未得到研究工作者的重视。而自1991年第一个脂滴相关蛋白的出现,脂滴的脂质组学以及蛋白质组学研究得到迅速发展,研究表明脂滴并非一个简单的能量存储器而是细胞内复杂、活跃、动态变化的细胞器。为了满足对脂滴高时间分辨、原位监测的要求,荧光成像技术逐渐受到脂滴研究工作者的青睐。然而,目前脂滴研究仍停留在共聚焦成像层次,脂滴融合、与其他细胞器作用等过程仍需要更高的空间分辨率以实现对精细结构的观察。

近些年超分辨技术的日趋成熟为脂滴进一步在高分辨率下的研究提供了契机。但是,目前商业脂滴染料多为氟硼吡咯类染料(如bodipy515),且光稳定较差,很难应用于超分辨技术的高功率激光。此外,该类染料的激发波长较短,通常为488nm,对细胞损伤较大,很难实现活细胞的长时间监测。因此,能够用于超分辨技术的近红外区脂滴荧光染料较为匮乏,这类脂滴染料的构建存在一定挑战性但必将会带给脂滴相关研究更大的机遇。



技术实现要素:

本发明的目的是提供一种用于超分辨成像的脂滴荧光染料及其合成和生物应用。

一种用于超分辨成像的脂滴荧光染料,该染料荧光发射波长达到750nm,荧光亮子产率达到0.4,能够广泛应用于超分辨荧光成像技术。

本发明一种用于超分辨成像的脂滴荧光染料,该荧光染料具有如下结构:

其中r1为

r2为

本发明一种用于超分辨成像的脂滴荧光染料,以苝酰亚胺为荧光基团,在其9,10-位刚性环结构,使得荧光激发波长及荧光发射波长红移至近红外区,且稳定性得到大幅提升。该类荧光染料能够特异性标记多种细胞内脂滴,具有波长长、染色浓度低、快速染色、生物相容性好等特点,能够用于活细胞、活体成像。

一种用于超分辨成像的脂滴荧光染料的合成方法,其合成路线如下:

具体合成步骤如下:

(1)中间体n-烷基-9,10-二溴-1,6,7,12-四氯苝酰亚胺的合成:

将9,10-二溴-1,6,7,12-四氯苝酰亚胺与二甘醇胺或丁胺溶于n-甲基吡咯烷酮与冰醋酸混合液中;将反应液加热至100-140℃,搅拌1-10h;将反应液泠却至室温后倒入冰水中抽滤得黑色固体,真空干燥,经200-300目二氧化硅硅胶柱分离,以体积比1:0.25-6的二氯甲烷:石油醚为洗脱剂,减压除去溶剂得深红色固体n-烷基-9,10-二溴-1,6,7,12-四氯苝酰亚胺;

(2)探针n-烷基-9,10-二脂肪胺基-1,6,7,12-四氯苝酰亚胺的合成:

将n-烷基-9,10-二溴-1,6,7,12-四氯苝酰亚胺,溶于乙二醇甲醚中,并向其中加入氮杂环丁烷或环己二胺;而后将反应液缓慢升温至90-130℃,并在氮气保护下反应10-24h;减压除去溶剂,经200-300目二氧化硅硅胶柱分离,以体积比1:1-0的二氯甲烷和石油醚为洗脱剂,减压除去溶剂,得蓝色固体探针n-烷基-9,10-二脂肪胺基-1,6,7,12-四氯苝酰亚胺;

步骤(1)中,9,10-二溴-1,6,7,12-四氯苝酰亚胺与二甘醇胺或丁胺的质量比为1-20:2;

9,10-二溴-1,6,7,12-四氯苝酰亚胺的质量与n-甲基吡咯烷酮与醋酸混合液的体积比为1:20-120g/ml;

n-甲基吡咯烷酮与冰醋酸的体积比为1-3:3-4。

步骤(2)中,n-烷基-9,10-二溴-1,6,7,12-四氯苝酰亚胺与氮杂环丁烷或环己二胺的质量比为1-8:1-6;

氮杂环丁烷或环己二胺的质量与乙二醇甲醚的体积比为5-120:1g/ml。

本发明提供一种用于超分辨成像的脂滴荧光染料的合成方法,该方法具有简单易操作、原料廉价、提纯方便等优点。

一种如用于超分辨成像的脂滴荧光染料在脂滴的共聚焦及超分辨荧光成像领域的应用。

本发明具有以下特点:

本发明的染料拥有合成原料价廉、方法简单且易于拓展等优点。

本发明的染料在在乙醇中荧光激发波长能够达到710nm以上,荧光量子产率>0.40;荧光发射波长达到750nm左右。

该类染料荧光发射波长及激发波长均达到了近红外区,组织穿透能力强,对细胞损伤小,更有利于活细胞、组织及活体成像。

此类染料在活细胞中能够对脂滴进行精准定位,并实现荧光共聚焦及超分辨成像。

附图说明

图1实施例1制备的n-丁基-9,10-二-氮杂环丁基-1,6,7,12-四氯苝酰亚胺(buld-daze)的核磁谱图氢谱。

图2实施例2制备的n-(2-(2-羟基)-乙氧基)乙基-9,10-二-氮杂环丁基-1,6,7,12-四氯苝酰亚胺(old-daze)的核磁谱图氢谱。

图3实施例4制备的n-(2-(2-羟基)-乙氧基)乙基-9,10-环己二胺基-1,6,7,12-四氯苝酰亚胺(old-710)的核磁谱图氢谱。

图4为实施例2制备的脂滴染料old-daze在乙醇中的归一化紫外吸收及荧光谱图,横坐标为波长,纵坐标为归一化强度,荧光探针的浓度为10μm。

图5为实施例4制备的脂滴染料old-710乙醇中的归一化紫外吸收及荧光谱图,横坐标为波长,纵坐标为归一化强度,荧光探针的浓度为10μm。

图6中实施例2制备的脂滴染料old-daze在脂肪细胞中荧光共聚焦成像图。

图7中实施例2制备的脂滴染料old-daze在ht29结肠癌细胞)中结构光照明显微(sim)荧光成像图。

图8中实施例4制备的脂滴染料old-710在ht29(结肠癌细胞)中结构光照明显微(sim)荧光成像图。

图9中实施例2制备的脂滴染料old-daze在ht29(结肠癌细胞)中受激辐射损耗(sted)显微像图。

具体实施方式

实施例1

脂滴荧光染料buld-daze的合成方法。

中间体n-丁基-9,10-二溴-1,6,7,12-四氯苝酰亚胺的合成:

将1,6,7,12-四氯-9,10-二溴-3,4-苝酐(1.2g,1.96mmol)溶于乙酸与n-甲基吡咯烷酮混合液60ml(1:1,v/v),而后向其中滴加正丁胺(428mg,5.86mmol)。120℃反应1h后,将反应液倒入200ml冰水中,沉降并过滤得黑色固体。黑色固体经硅胶柱分离(石油醚:二氯甲烷=1:1,v/v)得红色固体600mg,产率46%。其核磁谱图氢谱数据如下:

1hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.59(s,2h),8.14(s,2h),4.38–4.11(m,2h),1.94–1.66(m,2h),1.56–1.38(m,2h),0.99(t,j=7.1hz,3h).

染料n-丁基-9,10-二-氮杂环丁基-1,6,7,12-四氯苝酰亚胺的合成:

将n-丁基-1,6,7,12-四氯-9,10-二溴-3,4-苝酰亚胺(200mg,0.30mmol)与氮杂环丁烷(50mg,0.87mmol)溶于10ml乙二醇甲醚,并将其加热至120℃。12h后减压除去溶剂,残余物经硅胶柱分离(石油醚:二氯甲烷=1:4,v/v)得蓝绿色固体46mg,产率25%。实施例1制备的染料n-丁基-9,10-二-氮杂环丁基-1,6,7,12-四氯苝酰亚胺的核磁谱图氢谱如图1所示,具体数据如下:

1hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.52(s,2h),6.55(s,2h),4.25–4.19(m,2h),4.09(s,8h),2.48(s,4h),1.79–1.67(m,2h),1.48(dd,j=14.9,7.4hz,2h),0.99(t,j=7.4hz,3h).

经检测,其结构如上式buld-daze所示,该染料能够定位于活细胞内脂滴并实现超分辨荧光成像。

实施例2

脂滴荧光染料old-daze的合成方法。

中间体n-(2-(2-羟基)-乙氧基)乙基-9,10-二溴-1,6,7,12-四氯苝酰亚胺的合成:

将1,6,7,12-四氯-9,10-二溴-3,4-苝酐(1.2g,1.96mmol)溶于乙酸与n-甲基吡咯烷酮混合液144ml(4:1,v/v),而后向其中滴加二甘醇胺(303mg,8.79mmol)。100℃反应6h后,将反应液倒入150ml冰水中,沉降并过滤得黑色固体。黑色固体经硅胶柱分离(石油醚:二氯甲烷=1:1-1:4,v/v)得红色固体380mg,产率55%。其核磁谱图氢谱数据如下:

1hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.60(s,2h),8.13(s,2h),4.67–4.41(m,2h),3.88(d,j=5.3hz,2h),3.71(d,j=4.5hz,2h),3.67(d,j=3.6hz,2h),2.38(s,1h).

染料n-(2-(2-羟基)-乙氧基)乙基-9,10-二-氮杂环丁基-1,6,7,12-四氯苝酰亚胺(old-daze)的合成:

将old-dbr(200mg,0.28mmol)与氮杂环丁烷(104mg,1.42mmol)溶于10ml乙二醇甲醚,并将其加热至90℃。24h后减压除去溶剂,残余物经硅胶柱分离(展开剂:二氯甲烷)得蓝绿色固体60mg,产率32%。实施例2制备的染料n-(2-(2-羟基)-乙氧基)乙基-9,10-二-氮杂环丁基-1,6,7,12-四氯苝酰亚胺的核磁谱图氢谱如图2所示,具体数据如下:

1hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.53(s,2h),6.57(s,2h),4.57–4.37(m,2h),4.10(s,8h),3.88(d,j=4.9hz,2h),3.71(s,4h),2.50(s,4h).

经检测,其结构如上式old-daze所示,该染料能够定位于活细胞内脂滴并实现超分辨荧光成像。

将old-daze溶解于dmso溶液中,配制成2mm母液,根据需要制配成不同浓度测试溶液,检测其荧光光谱、激发光谱及细胞内脂滴荧光成像。

old-daze在乙醇中的荧光激发与发射光谱测试。每次取20μl染料母液,分别加入4ml乙醇中,配制成10μm的荧光探针测试液,并进行荧光激发与发射光谱测试。

终浓度为10μm的old-daze在乙醇中的归一化荧光谱图如图4所示:old-daze乙醇中的荧光发射波长达到了733nm,激发波长为706nm,激发与发射波长达到了近红外发射波长。

实施例3

近红外染料buld-710的合成方法。

染料n-丁基-9,10-环己二胺基-1,6,7,12-四氯苝酰亚胺的合成:

将n-丁基-1,6,7,12-四氯-9,10-二溴-3,4-苝酰亚胺(200mg,0.30mmol)与反式环己二胺(228mg,2.00mmol)溶于10ml乙二醇甲醚,并将其加热至110℃。14h后减压除去溶剂,残余物经硅胶柱分离(石油醚:二氯甲烷=1:4,v/v)得蓝绿色固体56mg,产率30%。其核磁谱图氢谱数据如下:

1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ8.24(d,j=3.7hz,2h),8.11(s,1h),7.96(s,1h),7.17(d,j=10.8hz,2h),,4.28(t,j=6.5hz,2h),3.21(d,j=10.0hz,2h),2.26(d,j=10.9hz,2h),1.94-1.68(m,2h),1.77(s,2h),1.56-1.38(m,2h),1.41(s,2h),1.25(s,2h),0.99(t,j=7.1hz,3h).

经检测,其结构如上式buld-710所示,该染料能够标记活细胞内脂滴并实现超分辨荧光成像。

实施例4

脂滴荧光染料old-710的合成方法。

染料n-(2-(2-羟基)-乙氧基)乙基-9,10-环己二胺基-1,6,7,12-四氯苝酰亚胺(old-710)的合成:

将n-(2-(2-羟基)-乙氧基)乙基--9,10-二溴-1,6,7,12-四氯苝酰亚胺(200mg,0.28mmol)与反式环己二胺(1200mg,10.5mmol)溶于10ml乙二醇甲醚,并将其加热至130℃。16h后减压除去溶剂,残余物经硅胶柱分离(展开剂:二氯甲烷)得蓝绿色固体80mg,产率43%。实施例4制备的染料n-(2-(2-羟基)-乙氧基)乙基-9,10-环己二胺基-1,6,7,12-四氯苝酰亚胺的核磁谱图氢谱如图3所示,具体数据如下:

1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ8.24(d,j=3.7hz,2h),8.10(s,1h),7.94(s,1h),7.17(d,j=10.8hz,2h),4.60(s,1h),4.26(t,j=6.5hz,2h),3.65(t,j=6.6hz,2h),3.48(s,4h),3.21(d,j=10.0hz,2h),2.26(d,j=10.9hz,2h),1.76(s,2h),1.40(s,2h),1.22(s,2h).

经检测,其结构如上式old-710所示,该染料能够标记活细胞内脂滴并实现超分辨荧光成像

将old-710溶解于dmso溶液中,配制成2mm母液,根据需要制配成不同浓度测试溶液,检测其荧光光谱、激发光谱。

old-710在乙醇中的荧光激发与发射光谱测试。每次取20μl染料母液,分别加入4ml乙醇中,配制成10μm的荧光探针测试液,并进行荧光激发与发射光谱测试。

终浓度为10μm的old-710在乙醇中的归一化荧光谱图如图5所示:old-710乙醇中的荧光发射波长达到了750nm,激发波长为712nm,激发与发射波长达到了近红外发射波长。

将该类染料分别溶解于dmso溶液中,配制成不同染料的2mm母液,根据需要制配成不同浓度测试溶液,用于活细胞内脂滴荧光成像。

实施例5

old-daze对脂肪细胞染色后荧光成像实验。取0.5μlold-daze母液溶于1ml细胞培养液中,37℃,5%co2下孵育10分钟后分别进行荧光共聚焦成像。激发波长为640nm。

含old-daze终浓度为1μm的细胞培养液孵育脂肪细胞(ht-29)10分钟后共聚焦荧光成像如图6所示:脂肪细胞内圆形脂滴清晰可见,old-daze对不同大小脂滴均能实现染色。

实施例6

old-daze、old-710对活细胞染色后结构光照明显微荧光成像检测。取0.5μl染料母液溶于1ml细胞培养液中,37℃,5%co2下孵育10分钟后sim成像。

old-daze终浓度为1μm的细胞培养液孵育结肠癌细胞(ht-29)10分钟后sim成像图如图7所示:ht-29内脂滴结构更清晰,分辨率达到120nm。

old-710终浓度为1μm的细胞培养液孵育结肠癌细胞(ht-29)10分钟后sim成像图如图8所示:ht-29内脂滴结构清晰。

实施例8

old-daze对ht29染色后结受激辐射损耗荧光成像实验。取0.5μl母液溶于1ml细胞培养液中,室温下下孵育10分钟。而后将孵育好的细胞用1ml4%甲醛pbs缓冲液室温固定15分钟,而后用pbs洗涤3次并用1mlpbs孵育已固定的细胞。

old-daze能够对ht29细胞sted荧光成像图如图9所示:old-daze能够对ht29细胞内脂滴进行精准定位,且细胞固定后仍然具有好的标记能力,能在sted高激光强度下进行荧光成像。


技术特征:

1.一种用于超分辨成像的脂滴荧光染料,其特征在于该类超分辨脂滴荧光染料的结构如下:

其中r1为

r2为

2.一种如权利要求1所述的一类用于超分辨成像的脂滴荧光染料的合成方法,其特征在于包含步骤如下:

(1)中间体n-烷基-9,10-二溴-1,6,7,12-四氯苝酰亚胺的合成:

将9,10-二溴-1,6,7,12-四氯苝酰亚胺与二甘醇胺或丁胺溶于n-甲基吡咯烷酮与冰醋酸混合液中;将反应液加热至100-140℃,搅拌1-10h;将反应液泠却至室温后倒入冰水中抽滤得黑色固体,真空干燥,经200-300目二氧化硅硅胶柱分离,以体积比1:0.25-6的二氯甲烷:石油醚为洗脱剂,减压除去溶剂得深红色固体n-烷基-9,10-二溴-1,6,7,12-四氯苝酰亚胺;

(2)探针n-烷基-9,10-二脂肪胺基-1,6,7,12-四氯苝酰亚胺的合成:

将n-烷基-9,10-二溴-1,6,7,12-四氯苝酰亚胺,溶于乙二醇甲醚中,并向其中加入氮杂环丁烷或环己二胺;而后将反应液缓慢升温至90-130℃,并在氮气保护下反应10-24h;减压除去溶剂,经200-300目二氧化硅硅胶柱分离,以体积比1:1-0的二氯甲烷和石油醚为洗脱剂,减压除去溶剂,得蓝色固体探针n-烷基-9,10-二脂肪胺基-1,6,7,12-四氯苝酰亚胺。

3.根据权利要求1所述的一类用于超分辨成像的脂滴荧光染料的合成方法,其特征在于步骤(1)中,9,10-二溴-1,6,7,12-四氯苝酰亚胺与二甘醇胺或丁胺的质量比为1-20:2;

9,10-二溴-1,6,7,12-四氯苝酰亚胺的质量与n-甲基吡咯烷酮与醋酸混合液的体积比为1:20-120g/ml;

n-甲基吡咯烷酮与冰醋酸的体积比为1-3:3-4。

4.根据权利要求1所述的一类用于超分辨成像的脂滴荧光染料的合成方法,其特征在于步骤(2)中,n-烷基-9,10-二溴-1,6,7,12-四氯苝酰亚胺与氮杂环丁烷或环己二胺的质量比为1-8:1-6;

氮杂环丁烷或环己二胺的质量与乙二醇甲醚的体积比为5-120:1g/ml。

5.一种如权利1所述的用于超分辨成像的脂滴荧光染料在脂滴的共聚焦及超分辨荧光成像领域的应用。

技术总结
本发明提供了一种用于超分辨成像的脂滴荧光染料及其合成和生物应用,该荧光染料基于苝酰亚胺,在供电基一端引入刚性环设计合成,其结构式如(1)所示,其刚性环的引入严格限制了分子内的扭转,使该类染料光稳定及亮度得到了大幅提升,荧光量子产率均达到0.4以上,摩尔消光系数达到50000M‑1cm‑1。此外,双供电基的强供电性大幅度提升了染料的荧光激发与发射波长,这导致这类染料在乙醇中的激发波长达到了710nm以上,荧光发射最高达到750nm。本项目设计的用于超分辨成像的脂滴荧光染料实现了不同超分辨技术下的成像,同时在组织及活体成像中具有较好应用前景。

技术研发人员:徐兆超;乔庆龙
受保护的技术使用者:中国科学院大连化学物理研究所
技术研发日:2018.12.18
技术公布日:2020.06.26

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