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最新一种高通量测定化合物体外代谢稳定性的方法及应用与流程

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泰宁新闻网 http://www.tainingxinwen.cn 2020-10-18 02:57 出处:网络
这篇文章提供的最新一种高通量测定化合物体外代谢稳定性的方法及应用与流程,来看看小编为您制定的逆袭内容

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本发明属于药物代谢动力学研究领域,涉及一种测定方法及其应用,具体涉及一种高通量测定化合物体外代谢稳定性的方法及应用。
背景技术
:高通量的测定化合物体外代谢稳定性的方法,现有技术分两种,一种是使用离心管操作,不能实现高通量,并且不能测定回收率;一种是96孔板操作,此法实现了高通量,但是不能测定回收率。现有方法中都是将微粒体、化合物、NADPH混合后,按照时间点依次终止反应:使用离心管时,每到一个时间点,从反应体系中取出混合物加入乙腈终止,缺点是繁琐,不能同时做很多化合物,并且如果混合不充分,取出的混合物可能不一致,影响测定结果,并且没有设计不加NADPH的对照,不能计算回收率;已有的96孔板法,也是在每到一个时间点,用乙腈终止反应后还要继续孵育,因为其他孔还在反应,乙腈是易挥发的溶剂,等到后面的时间点终止好,前面孔中的乙腈已经挥发很多,直接影响测定的准确性,并且也没有设计不加NADPH的对照,不能计算回收率。技术实现要素:为解决现有技术中存在的上述问题,本发明是在96孔板操作的基础上,将试验操作方案进行改进,并设计了回收率的测定,不但实现高通量筛选,还能检测出化合物的代谢过程是否是NADPH依赖。本发明的技术方案为:一种高通量测定化合物体外代谢稳定性的方法,其包括以下步骤:(1)设计96孔板:准备两个96孔板,一个为体系配置板;一个为体系孵育板;体系配置板上设定有微粒体孔、回收率孔,体系孵育板上设定有空白对照孔、回收率孔、反应不同时间点孔;(2)稀释微粒体:向体系配置板的微粒体孔中加入肝微粒体28.8μl/孔,使用PBS稀释肝微粒体至蛋白浓度为0.58mg/ml,将体系配置板移至振荡器上,低速振荡30s,得到稀释的微粒体;(3)转移空白对照孔:从步骤(2)的稀释的微粒体中取出130μl,转移至体系孵化板的空白对照孔中作为空白对照组,并加入20μl的PBS;(4)微粒体与化合物混合:向体系配置板的微粒体孔中加入10μl化合物,并低速振荡1min,得到混合微粒体;(5)转移各反应时间点孔:从步骤(4)的混合微粒体中依次取出130μl,转移至体系孵化板中的反应不同时间点孔;(6)转移回收率孔:从步骤(4)的混合微粒体中取出130μl,转移至体系配置板的回收率孔中;并加入20μlPBS和300μl含有内标的终止试剂终止反应,完成之后将体系配置板热封;(7)孵育体系孵化板:把体系孵化板放在37℃的恒温孵育器上开始温孵,在不同的时间点依次向相对应的反应不同时间点孔中加入20μlNADPH,在第35min向0min孔中加入20μlNADPH,即反应时间为0min,然后立刻向所有孔中各加入300μl的含有内标的终止试剂终止反应;(8)再次转移回收率孔:将体系配置板中所有回收率孔中的混合物对应的转移至体系孵化板的回收率孔中,将体系孵化板热封;(9)振荡离心:将体系孵化板振荡10min后,4℃,6000g下,离心10min(离心条件优选为4℃,6000g),然后取上清70μl至一个96孔浅孔板中,进LC-MS/MS分析,检测各孔中化合物原形的质谱响应As和内标的质谱响应Ai;(10)计算清除率及回收率:利用化合物质谱响应As、内标质谱响应Ai,计算As/Ai值,计算剩余百分比,计算LN;剩余百分比(%)=不同时间点的(As/Ai)/0min的(As/Ai)×100;LN=ln(剩余百分比);以时间为横坐标,以LN为纵坐标,做散点图,添加趋势线,得到线性回归方程,确定趋势线的斜率,计算清除率和回收率,清除率(CL,μl/min/mgprotein)=斜率的绝对值/微粒体蛋白浓度(单位mg/ml)×1000,回收率(recovery,%)=(反应时间为0min的孔的As/Ai)/(回收率孔的As/Ai)×100。其中微粒体蛋白浓度是指加入含有内标的终止试剂终止反应之前的微粒体的蛋白浓度,即0.58mg/ml×130μl/(130+20)μl=0.5mg/ml。回收率的计算可以用于初步判断化合物的代谢过程是否是NADPH依赖,即比较加NADPH和不加NADPH时化合物响应的变化,当回收率<80%时,化合物可能存在非NADPH依赖的代谢,具体的确认还需进步一研究。优选的,步骤(5)中的反应不同时间点孔分别设定为0min孔、5min孔、10min孔和30min孔;即相对应的,步骤(7)中,在第5min向30min孔中加入NADPH,即反应时间为5min;在第25min向10min孔中加入NADPH,即反应时间为10min;在第30min向5min孔中加入NADPH,即反应时间为5min;在第35min向0min孔中加入NADPH,即反应时间为0min, 完成之后立刻用多道移液器向所有的孔中加入含有内标的终止试剂终止反应。本发明所述的高通量测定化合物体外代谢稳定性的方法可以同时测定n个化合物,即对应n个化合物,在体系配置板上设定有n个微粒体孔、n个回收率孔,在体系孵育板上设定有n个空白对照孔、n个回收率孔、以及n个化合物的反应不同时间点孔,1≤n≤16。所述终止试剂优选为乙腈或甲醇。本发明还提供了使用上述测定方法来初步判断代谢类型是NADPH依赖型代谢还是非NADPH依赖型代谢的应用。即比较加NADPH和不加NADPH时化合物响应的变化,如果化合物的回收率在80%-120%的范围内,则认为该化合物主要经NADPH依赖的肝微粒酶代谢,则其代谢稳定性也主要与肝微粒酶相关;如果化合物的回收率低于80%,则化合物可能还存在非NADPH依赖的代谢,具体的确认还需进步一研究。有益效果:本发明中,使用96孔板解决了高通量问题;运用倒序的加入NADPH启动反应,并在同一时间加入终止试剂终止反应,解决了乙腈等终止试剂挥发的问题;还设计了不加NADPH的对照组recovery,能够计算回收率,继而发现筛选出那些不依赖于NADPH代谢的化合物。具体实施方式1、设计96孔板(以16个化合物为例)其中:板1为体系配置板;板2为体系孵育板;testNumber:化合物序号(96孔板最 多可同时测定16个化合物,即用test1-test16代表化合物1-16);Blank:空白对照孔;Recovery:回收率孔;0min、5min、10min、30min:反应不同时间点孔。具体的,testNumber-微粒体孔:该化合物的微粒体孔;testNumber-Blank:该化合物的空白对照孔;testNumber-Recovery:该化合物的回收率孔;testNumber-0min:该化合物的反应0min孔;testNumber-10min:该化合物的反应10min孔;testNumber-15min:该化合物的反应15min孔;testNumber-30min:该化合物的反应30min孔。2、稀释微粒体实验之前从-70℃取出肝微粒体(HLM,微粒体蛋白浓度20mg/ml),37℃溶解后,按28.8μl/孔加入板1的test1-test16微粒体孔中,再向每孔中加入958μl预冷的磷酸缓冲盐(PBS,pH7.4),将板1移至振荡器上,低速振荡30s,得到稀释的微粒体,稀释后的微粒体的蛋白浓度为0.58mg/ml。3、转移空白对照孔使用8道移液器,从稀释的微粒体中取出130μl,转移至板2的test1-Blank---test16-Blank孔作为Blank,并分别加入20μlPBS。4、微粒体与化合物混合向板1的test1-test16微粒体孔中加入10μl的化合物test1-test16的工作液(化合物用乙腈调配至浓度为100μM的工作液),并低速振荡1min,得到混合微粒体。5、转移各反应时间点孔使用8道移液器,从步骤4制备好的板1的混合微粒体中各取出130μl,对应的转移至板2的test1-0min---test16-0min作为0min;再次取出130μl转移至板2的test1-5min---test16-5min孔作为5min孔;再次取出130μl转移至板2的test1-10min---test16-10min孔作为10min孔;再次取出130μl转移至板2的test1-30min---test16-30min孔作为30min孔。6、转移回收率孔使用8道移液器,从步骤4制备好的板1的混合微粒体中各取出130μl,对应的转移至板1的test1-Recovery---test16-Recovery孔作为Recovery,并各加入20μlPBS和300μl含有内标的乙腈终止反应,完成之后将板1热封,热封温度170℃左右,时间10秒。7、孵育板2把板2放在37℃的恒温孵育器上开始温孵。在第5min,用8道移液器向30min孔中加入20μlNADPH。在第25min,用8道移液器向10min孔中加入20μlNADPH。在第30min,用8道移液器向5min孔中加入20μlNADPH。在第35min,用8道移液器向0min孔中加入20μlNADPH,完成之后立刻用多道移液器向所有的孔中加入300μl含有内标的乙腈终止反应。8、再次转移Recovery使用8道移液器,将板1中的所有Recovery孔中的混合物,转移至板2的test1-Recovery---test16-Recovery孔中,完成之后将板2热封,热封温度170℃左右,时间10秒。9、振荡离心将板2震摇10min后,4℃,6000g下,离心10min,然后取上清70μl至96孔浅孔板中,进LC-MS/MS分析,检测每孔中化合物原形的质谱响应As和内标的质谱响应Ai。质谱响应是指在质谱检测时,化合物和内标本身的分子离子峰的峰面积。10、计算清除率及回收率利用化合物质谱响应As、内标质谱响应Ai,计算As/Ai值,计算剩余百分比,计算LN。剩余百分比(%)=不同时间点的(As/Ai)/0min的(As/Ai)×100。LN=ln(剩余百分比)。以时间为横坐标,以LN为纵坐标,做散点图,添加趋势线,得到线性回归方程,确定趋势线的斜率,计算清除率和回收率,清除率(CL,μl/min/mgprotein)=斜率的绝对值/微粒体蛋白浓度(单位mg/ml)×1000,回收率(recovery,%)=(反应时间为0min的孔的As/Ai)/(回收率孔的As/Ai)×100。其中微粒体蛋白浓度是指加入含有内标的乙腈终止反应之前的微粒体的蛋白浓度,即0.58mg/ml×130μl/(130+20)μl=0.5mg/ml。根据计算结果,判断化合物的体外代谢稳定性情况,在新药研发早期实现高通量筛选的目的,并发现那些非NADPH依赖代谢的化合物,为化合物结构设计提供依据。回收率的计算可以用于初步判断化合物的代谢过程是否是NADPH依赖,即比较加NADPH和不加NADPH时化合物响应的变化,当回收率<80%时,化合物可能存在非NADPH依赖的代谢,具体的确认还需进步一研究。化合物1-5的测定根据上述步骤,我们具体的选择了5种化合物在肝微粒体中进行试验,对化合物1-5进行了检测和计算,检测和计算结果如下。化合物1-5分别为咪达唑仑、普萘洛尔、阿替洛尔、化合物4、化合物5,内标为替硝唑。化合物1的测试结果化合物1的As、Ai测定结果,剩余百分比及LN的计算结果见表1:表1化合物1测试结果化合物质谱响应As内标质谱响应AiAs/Ai剩余百分比,%LNtest1-HLM-Blank737376740.00test1-HLM-Recovery21166157714312.74test1-HLM-0min22559687286573.10100.04.6test1-HLM-5min11286747241241.5650.33.9test1-HLM-10min5904187122590.8326.83.3test1-HLM-30min571586925880.082.71.0test1-HLM-Blank代表化合物1的空白对照孔,test1-HLM-Recovery代表化合物1的回收率孔,test1-HLM-0min代表化合物1的反应时间为0min的反应时间点孔,test1-HLM-5min代表化合物1的反应时间为5min的反应时间点孔,test1-HLM-10min代表化合物1的反应时间为10min的反应时间点孔,test1-HLM-30min代表化合物1的反应时间为30min的反应时间点孔,其他化合物2~15的表格中的缩写定义参照此表。以时间为横坐标,以LN为纵坐标,做散点图,添加趋势线,得到线性回归方程y=-0.1318x+4.5960,确定趋势线的斜率绝对值为0.1318,计算得到清除率为262μl/min/mgprotein,回收率为113%。化合物2的测试结果化合物2的As、Ai测定结果,剩余百分比及LN的计算结果见表2:表2化合物2测试结果化合物质谱响应As内标质谱响应AiAs/Ai剩余百分比,%LNtest2-HLM-Blank786680560.00test2-HLM-Recovery1596557278700.22test2-HLM-0min1480416824830.22100.04.6test2-HLM-5min1427297015800.2093.84.5test2-HLM-10min1426687097600.2092.74.5test2-HLM-30min1500436919820.22100.04.6以时间为横坐标,以LN为纵坐标,做散点图,添加趋势线,得到线性回归方程为y=0.0009x+4.5594,确定趋势线的斜率为0,计算得到清除率为0μl/min/mgprotein,回收率为99%。化合物3的测试结果化合物3的As、Ai测定结果,剩余百分比及LN的计算结果见表3:表3化合物3测试结果化合物质谱响应As内标质谱响应AiAs/Ai剩余百分比,%LNtest3-HLM-Blank1326850960.00test3-HLM-Recovery432367441980.06test3-HLM-0min412266765420.06100.04.6test3-HLM-5min388026623120.0696.14.6test3-HLM-10min357026427700.0691.24.5test3-HLM-30min307956651320.0576.04.3以时间为横坐标,以LN为纵坐标,做散点图,添加趋势线,得到线性回归方程y=-0.0092x+4.6074,确定趋势线的斜率绝对值为0.009,计算得到清除率为18μl/min/mgprotein,回收率为105%。化合物4的测试结果化合物4的As、Ai测定结果,剩余百分比及LN的计算结果见表4:表4化合物4测试结果化合物质谱响应As内标质谱响应AiAs/Ai剩余百分比,%LNtest4-HLM-Blank10136757490.00test4-HLM-Recovery8047577504611.07test4-HLM-0min8714006817181.28100.04.6test4-HLM-5min8540586726641.2799.34.6test4-HLM-10min8157486814501.2093.74.5test4-HLM-30min7830446671721.1791.84.5以时间为横坐标,以LN为纵坐标,做散点图,添加趋势线,得到线性回归方程y=-0.0028x+4.5978,确定趋势线的斜率的绝对值为0.0028,计算得到清除率为4μl/min/mgprotein,回收率为119%。化合物5的测试结果化合物5的As、Ai测定结果,剩余百分比及LN的计算结果见表1:表5化合物5测试结果化合物质谱响应As内标质谱响应AiAs/Ai剩余百分比,%LNtest5-HLM-Blank19693980.00test5-HLM-Recovery21004630800.33test5-HLM-0min7607646490.12100.04.6test5-HLM-5min2168581270.0431.73.5test5-HLM-10min1158644370.0215.32.7test5-HLM-30min243593490.003.51.2以时间为横坐标,以LN为纵坐标,做散点图,添加趋势线,得到线性回归方程为y=-0.187x+4.535,确定趋势线的斜率的绝对值为0.187,计算得到清除率为374μl/min/mgprotein,回收率为35%。因为肝脏为药物代谢的主要器官,而肝脏的主要代谢酶为肝微粒体酶。大部分药物在肝脏代谢,最终清除到体外。所以考察化合物在肝脏的代谢稳定性,能反映化合物在体内的清除情况。本试验中,如果化合物的清除率比较低,则说明其代谢稳定性比较好,即被肝微粒体酶代谢比较少;如果化合物的清除率比较高,则说明其代谢稳定性比较差,即被肝微粒体酶代谢比较多。回收率的计算与化合物的代谢类型有关,肝微粒酶的代谢是NADPH依赖的,如果化合物的回收率在80%-120%的范围内,则认为该化合物主要经NADPH依赖的肝微粒酶代谢,则其代谢稳定性也主要与肝微粒酶相关;如果化合物的回收率低于80%,则提示该化合物可能还被非NADPH依赖的其他酶代谢,则其代谢稳定性就比较复杂,需要将此化合物与其他可能的代谢酶进行孵育,来判断其的代谢类型。以上所述,仅为本发明的具体实施方式,但本发明的保护范围并不局限于此,任何熟悉本领域的技术人员在本发明所揭示的技术范围内,可不经过创造性劳动想到的变化或替换,都应涵盖在本发明的保护范围之内。当前第1页1 2 3 
技术特征:

1.一种高通量测定化合物体外代谢稳定性的方法,其特征在于,包括以下步骤:

(1)设计96孔板:准备两个96孔板,一个为体系配置板;一个为体系孵育板;体系配置板上设定有微粒体孔、回收率孔,体系孵育板上设定有空白对照孔、回收率孔、反应不同时间点孔;

(2)稀释微粒体:向体系配置板的微粒体孔中加入肝微粒体28.8μl/孔,使用PBS稀释肝微粒体至蛋白浓度为0.58mg/ml,将体系配置板移至振荡器上,低速振荡30s,得到稀释的微粒体;

(3)转移空白对照孔:从步骤(2)的稀释的微粒体中取出130μl,转移至体系孵化板的空白对照孔中作为空白对照组,并加入20μl的PBS;

(4)微粒体与化合物混合:向体系配置板的的微粒体孔中加入10μl化合物,并低速振荡1min,得到混合微粒体;

(5)转移各反应时间点孔:从步骤(4)的混合微粒体中依次取出130μl,转移至体系孵化板中的反应不同时间点孔;

(6)转移回收率孔:从步骤(4)的混合微粒体中取出130μl,转移至体系配置板的回收率孔中;并加入20μl PBS和300μl含有内标的终止试剂终止反应,完成之后将体系配置板热封;

(7)孵育体系孵化板:把体系孵化板放在37℃的恒温孵育器上开始温孵,在不同的时间点依次向相对应的反应不同时间点孔中加入20μl NADPH,在第35min向0min孔中加入20μl NADPH,即反应时间为0min,然后立刻向所有孔中各加入300μl的含有内标的终止试剂终止反应;

(8)再次转移回收率孔:将体系配置板中所有回收率孔中的混合物对应的转移至体系孵化板的回收率孔中,将体系孵化板热封;

(9)振荡离心:将体系孵化板振荡10min后,离心10min,然后取上清70μl至一个96孔浅孔板中,进LC-MS/MS分析,检测各孔中化合物原形的质谱响应As和内标的质谱响应Ai;

(10)计算清除率及回收率:利用化合物质谱响应As、内标质谱响应Ai,计算As/Ai值,计算剩余百分比,计算LN;剩余百分比(%)=不同时间点的(As/Ai)/0min的(As/Ai)×100;LN=ln(剩余百分比);

以时间为横坐标,以LN为纵坐标,做散点图,添加趋势线,得到线性回归方程,确定趋势线的斜率,计算清除率和回收率,清除率(CL,μl/min/mg protein)=斜率的绝对值/微粒体蛋白浓度(单位mg/ml)×1000,回收率(recovery,%)=(反应时间为0min的孔的 As/Ai)/(回收率孔的As/Ai)×100;其中微粒体蛋白浓度是指加入含有内标的终止试剂终止反应之前的微粒体的蛋白浓度。

2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:步骤(5)中的反应不同时间点孔分别设定为0min孔、5min孔、10min孔和30min孔;即相对应的,步骤(7)中,在第5min向30min孔中加入NADPH,即反应时间为5min;在第25min向10min孔中加入NADPH,即反应时间为10min;在第30min向5min孔中加入NADPH,即反应时间为5min;在第35min向0min孔中加入NADPH,即反应时间为0min。

3.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:同时测定n个化合物,即对应n个化合物,在体系配置板上设定有n个微粒体孔、n个回收率孔,在体系孵育板上设定有n个空白对照孔、n个回收率孔、以及n个化合物的反应不同时间点孔,1≤n≤16。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法,其特征在于:所述终止试剂为乙腈或甲醇。

5.权利要求1-4中任一项所述方法的应用,其特征在于:用于初步判断代谢类型是NADPH依赖型代谢或非NADPH依赖型代谢。

6.根据权利要求5所述的应用,其特征在于:如果化合物的回收率在80%-120%的范围内,则该化合物主要经NADPH依赖型代谢;如果化合物的回收率低于80%,则化合物可能存在非NADPH依赖型代谢。

技术总结
本发明提供了一种高通量测定化合物体外代谢稳定性的方法及应用。本发明中,使用96孔板解决了高通量问题;运用倒序的加入NADPH启动反应,并在同一时间加入终止试剂终止反应,解决了乙腈挥发的问题;还设计了不加NADPH的对照组recovery,能够计算回收率,继而发现筛选出那些不依赖于NADPH代谢的化合物。

技术研发人员:张乐多;徐佳;向志雄;臧卫军;姜靖彦
受保护的技术使用者:上海医药集团股份有限公司
文档号码:201510456201
技术研发日:2015.07.29
技术公布日:2017.02.15

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