泰宁新闻网

推荐核酸纯化柱再生的方法

泰宁新闻网 http://www.tainingxinwen.cn 2020-10-18 08:02 出处:网络
本站介绍的推荐核酸纯化柱再生的方法,为您描述后面内容: 专利名称:核酸纯化柱再生的方法

本站介绍的推荐核酸纯化柱再生的方法,为您描述后面内容:

专利名称:核酸纯化柱再生的方法
技术领域
本发明涉及一种核酸纯化柱再生的方法,尤其是一种操作简单、应用性强、便于普
及的核酸纯化柱再生的方法。
背景技术
核酸纯化是分子生物学研究的常规技术之一。现有核酸纯化方法通常分为以下三 种经典的碱裂解以及酚仿抽提法;未改良的硅胶膜吸附法;商品纯化柱法。由于经典方法 的费时以及未改良硅胶膜吸附法的局限性,使得简便、快捷的商品纯化柱纯化方法得到了 广泛的应用。然而,商品化核酸纯化柱价格较高且只作为一次性耗材使用,不仅增加了实验 开销,废弃的纯化柱还会对环境造成污染,具有潜在的危害性。因此,国内外学者开始探求 有效的核酸纯化柱再生方法。目前,虽然已有关于核酸纯化柱再生研究的报道,但是因其操 作复杂,实际应用性不理想、不便于普及等,使用一次性核酸纯化柱的污染与浪费问题仍得 不到有效解决。

发明内容
本发明为了解决现有技术所存在的上述技术问题,提供一种操作简单、应用性强、 便于普及的核酸纯化柱再生的方法。 本发明的技术解决方案是一种核酸纯化柱再生的方法,其特征在于按如下步骤 进行 a.将使用过的核酸纯化柱与外部套管分开,均置于3. 68M H2S04中煮沸10min,再 以无菌水冲洗纯化柱与套管3次; b.组装纯化柱与套管,向纯化柱中加700 iil无菌水,12000 Xg离心lmin,弃滤液, 重复此过程两次; c.向硅胶膜中央加入40iU灭菌的2. 5mM, pH8. 5的Tris-HCL,室温静置lmin, 12000 Xg离心2min ; d.纯化柱与外套管经121。C高压灭菌15min,60。C干燥,待用。
本发明充分利用了核酸在酸性条件下水解从而与核酸纯化柱上的硅胶膜分离的 原理,达到消除纯化柱上残留核酸污染的目的。所用的水解试剂为一定浓度的分析纯硫酸 溶液,Tris-HCL为实验室常规试剂,除此之外无需其它任何化学试剂,降低了再生利用的操 作成本,减小了对环境的污染;操作全过程只需要20分钟左右,较已报道的其它再生方法 快速,大幅提高了工作效率,因此具有较强的应用性,便于推广普及等优点。通过PCR、限制 酶切及核酸比色法对再生纯化柱的质量进行检测与评价,未发现有核酸残留污染,且能继 续使用。检测结果表明,经该技术再生的纯化柱至少可再生利用6次。


图1是本发明实施例再生处理后纯化柱滤液的PCR检测图。
图2是本发明实施例再生核酸纯化柱用紫外分光比色法(A)与电泳(B)检测再生 柱提取质粒DNA的含量与质量图。 图3是本发明实施例再生核酸纯化柱用PCR检测再生柱提取质粒DNA的质量图。
图4是本发明实施例再生核酸纯化柱用限制酶切检测再生柱提取质粒DNA的质量 图。
具体实施例方式
a.将使用过的核酸纯化柱与外部套管分开,均置于3. 68M H2S04中煮沸lOmin,再 以无菌水冲洗纯化柱与套管3次; b.组装纯化柱与套管,向纯化柱中加700 iil无菌水,12000 Xg离心lmin,弃滤液, 重复此过程两次; c.向硅胶膜中央加入40iU灭菌的2. 5mM, pH8. 5的Tris-HCL,室温静置lmin, 12000 Xg离心2min ; d.纯化柱与外套管经12rC高压灭菌15min,6(TC干燥,待用即可。 对本发明再生核酸纯化柱过程所产生的滤液及再生核酸纯化柱质量检测如下 1.对b步骤中产生的滤液进行PCR检测,反应体系如下 模板(滤液)liU, EX Buffer (Mg2+Plus) 2. 5 ii 1 , d證Mixture (each 2. 5mM) 2. 0 ii 1, 正向引物和反向引物各O. 5iil(10pmol/iil), EX Taq 0. 14 ii 1 ,以水补至25 ii 1 。 反应条件为94。C预变性2min ;94。C变性30s,55。C退火30s,72。C延伸30s,35个
循环;72t:延伸2min。反应结束后,各取5 iU扩增产物进行1 %琼脂糖凝胶电泳检测。结
果如下如图1所示。图中Rl-R6分别表示再生处理的次数,M为Maker ;每次再生处理后随
机取3只柱进行检测,以下均同。 2.核酸纯化柱再生利用效果的检测 (1)凝胶电泳与分光光度计比色定量检测 以新纯化柱和经不同再生次数的纯化柱提取同批连接有外源DNA片段的质粒,所 提取的质粒DNA于1%琼脂糖凝胶进行电泳检测。同时,采用紫外分光光度计对相应的质粒 DNA进行定量检测,结果如图2所示,图中New表示新柱,以下均同。
(2) PCR扩增检测 分别取新柱与再生柱提取的质粒进行PCR检领"反应体系与反应条件同上述对b 步骤中产生的滤液进行PCR检测(循环为30次),结果如图3所示。
(3)限制性双酶切检测 分别取新柱与再生柱提取的质粒进行限制性双酶切反应。反应体系包含10 iU质 粒,4iU lOXBuffer, HindIII 1 ii 1, BamHIl ii 1,以水补至20 ii 1。 37。C,lh。对酶切产物 进行1 %琼脂糖凝胶电泳检测,结果如图4所示。
权利要求
一种核酸纯化柱再生的方法,其特征在于按如下步骤进行a.将使用过的核酸纯化柱与外部套管分开,均置于3.68M H2SO4中煮沸10min,再以无菌水冲洗纯化柱与套管3次;b.组装纯化柱与套管,向纯化柱中加700μl无菌水,12000×g离心1min,弃滤液,重复此过程两次;c.向硅胶膜中央加入40μl灭菌的2.5mM,pH8.5的Tris-HCL,室温静置1min,12000×g离心2min;d.纯化柱与外套管经121℃高压灭菌15min,60℃干燥,待用。
全文摘要
本发明公开一种操作简单、应用性强、便于普及的核酸纯化柱再生的方法,具体步骤是将使用过的核酸纯化柱与外部套管分开,均置于3.68M H2SO4中煮沸10min,再以无菌水冲洗纯化柱与套管3次;组装纯化柱与套管,向纯化柱中加700μl无菌水,12000×g离心1min,弃滤液,重复此过程两次;向硅胶膜中央加入40μl灭菌的2.5mM,pH8.5的Tris-HCL,室温静置1min,12000×g离心2min;纯化柱与外套管经121℃高压灭菌15min,60℃干燥,待用即可。
文档编号B01D15/42GK101717421SQ20091022075
公开日2010年6月2日 申请日期2009年12月15日 优先权日2009年12月15日
发明者刘庆坤, 刘海映, 刘长伟, 姜玉声, 张剑诚, 李岑, 王吉桥, 郭雷蕾 申请人:大连水产学院

推荐核酸纯化柱再生的方法的相关内容如下:

本文标题:推荐核酸纯化柱再生的方法
http://www.tainingxinwen.cn/qitaxinxi/520951.html

0

精彩评论

暂无评论...
验证码 换一张
取 消