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推荐一种利用发酵废液制备生物酶的方法

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泰宁新闻网 http://www.tainingxinwen.cn 2020-10-18 09:05 出处:网络
如下提供的推荐一种利用发酵废液制备生物酶的方法,接下来的一段话,值得人深思!

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专利名称:一种利用发酵废液制备生物酶的方法
技术领域
本发明属于发酵废液再利用领域,特别涉及一种利用发酵废液制备生物酶的方法。
背景技术
随着全球能源危机、粮食危机和环境危机的到来,人们将目光转向木质纤维素资源——地球上最丰富、最廉价的可再生资源。木质纤维素是由纤维素、半纤维素和木质素的混合物组成,它们三组分相互交联在一起形成类似于钢筋混凝土的结构。由于木质纤维素的结构复杂,因此对木质纤维素资源进行预处理是获得相关发酵产物的重要的环节之一,其中木质纤维素降解酶(纤维素酶、木聚糖酶、漆酶等)在这一过程中又扮演着非常重要的角色。为了更好的利用木质纤维素资源,国内外对于木质纤维素降解酶的研究已经达到白热化,但迄今为止能够进行大规模生产较高酶活的优良菌株依然不多,因此,木质纤维素降解酶(纤维素酶、木聚糖酶、漆酶等)酶活比较低、成本过高成为研究开发中遇到的普遍问题。目前,提高木质纤维素降解酶产量的方法主要有三种(I)筛选优良菌株,获得酶活力最高的菌株;(2)用基因工程技术构建含木质纤维素酶基因的克隆菌株,表达具有较高活力的酶。(3)优化生产工艺提高酶的产量。这些方法在一定程度上提高了酶活力,但却导致了酶制剂的价格过高。生产木质纤维素降解酶的微生物包括真菌、细菌和放线菌。在众多的生产菌株中,里氏木霉、黑曲霉和米曲霉等具有降解纤维素与半纤维素的较完整的酶系,能同时合成多种降解木质纤维素酶类。发酵工业中,产品大规模发酵生产后会产生大量的发酵废液,如果不加以处理排放,会造成河流湖泊的COD和BOD急剧上升,环境污染严重。如果在废液直接排放前进行污水处理,由于处理成本高、处理负荷重,企业一直对此颇感头疼。

发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种利用发酵废液制备生物酶的方法,该方法利用废弃的发酵液高效制备出具有较高酶活力的木质纤维素降解酶,既降低了酶制剂的生产成本,也减少了发酵废液对环境带来的危害,有效实现发酵废弃物变废为宝、资源化再利用的低碳减排目的。本发明的一种利用发酵废液制备生物酶的方法,包括(I)将微生物在培养基中培养2-10天,分离获得剩余发酵废液;(2)利用上述剩余发酵废液制得生物酶生产菌的发酵培养基;(3)将生物酶生产菌的菌株接种到种子培养基于25-30°C,120-250r/min条件下培养24-48小时; (4)以5-10%接种量转接至由步骤⑵制得的发酵培养基中产酶,其中加入1-10%诱导物;(5)在25-30°C,120-250r/min条件下培养4-10天,过滤,离心得粗酶液。所述步骤(I)中的微生物为大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、木醋杆菌或酵母菌。所述大肠杆菌分离获得剩余发酵废液的具体工艺为将大肠杆菌取1-2环接种到含有1%胰蛋白胨或蛋白胨、0. 5%酵母浸膏、1% NaCl、pH7.0的培养基中,在37°C下培养24-72h后,用滤纸或0. 2微米的滤膜将培养基过滤或高速离心取上清液,获得大肠杆菌发 酵废液。所述金黄色葡萄球菌分离获得剩余发酵废液的具体工艺为将金黄色葡萄球菌取1-2环接种到含有0. 5%胰蛋白胨或蛋白胨、0. 3%牛肉膏、5% NaCl, pH7. 4的培养基中,在37°C下培养24-72h后,用滤纸或0. 2微米的滤膜将培养基过滤或高速离心取上清液,获得金黄色葡萄球菌发酵废液。所述木醋杆菌分离获得剩余发酵废液的具体工艺为将木醋杆菌取1-2环接种到含有2. 5%葡萄糖、0. 3%胰蛋白胨或蛋白胨、0. 5%酵母提取物、pH4. 0-7. 0的种子培养基中,25-30°C动态培养24h制备种子液,然后按体积百分比3-15%的接种量转接到发酵培养基中,30°C静置或动态培养7-14天,取出产生的细菌纤维素,获得木醋杆菌发酵废液。所述酵母菌分离获得剩余发酵废液的具体工艺为将酵母菌取1-2环接种到含有0. 5%胰蛋白胨或蛋白胨、I. 5%酵母浸膏、0. 5%硫酸铵、2%葡萄糖、pH5-6的培养基中,在30°C下培养24-72h后,用滤纸或0. 45微米的滤膜将培养基过滤或高速离心取上清液,获得酵母菌发酵废液。所述步骤(2)中的生物酶生产菌为里氏木霉、黑曲霉或米曲霉。所述步骤(2)中的发酵培养基的组分为剩余发酵废液中,补加0-1%葡萄糖,0. 1-1 % 蛋白胨,0. 05 % 柠檬酸,0. 015 % Tween 80,2 % Voger s medium N(125g/L 二水柠檬酸钠,250g/L KH2PO4,100g/L NH4NO3,10g/L MgSO4 7H20, 250 u g/L 生物素,5g/L CaCl2 2H20, 5mL/L微量兀素溶液,其中,微量兀素溶液含50g/L —水朽1檬酸,50g/LZnSO4 7H20,10g/LFe (NH4)2 (SO4)2 6H20, 2. 5g/L CuSO4 5H20,0. 5g/L MnSO4 H20,0. 5g/L H3BO3,0. 5g/LNa2Mo04 2H20),pH5. 0 ;或者是补加 0. 1_1%葡萄糖,0. 1-1%蛋白胨,终浓度为 0. 05M 的柠檬酸缓冲液,0. 015% Tween 80,0. 14% (NH4)2SO4jO. 2% KH2PO4,0. 03%尿素,0. 04% CaCl2 2H20,0. 03% MgSO4 7H20,0. 0005% FeSO4 7H20,0. 00016% MnSO4 H2O,0. 00014% ZnSO4 7H20,0. 00037% CoCl2 6H20(Mandels 培养基),以上百分比均为重量百分比。所述步骤(3)中的种子培养基包含1%葡萄糖,0. 1-1%蛋白胨,0.05%柠檬酸,0. 015% Tween 80,2% Voger s medium N(125g/L 二水柠檬酸钠,250g/L KH2PO4,100g/LNH4NO3,10g/L MgS04*7H20,250 ug/L 生物素,5g/L CaCl2 *2H20,5mL/L 微量元素溶液,其中,微量元素溶液含 50g/L —水柠檬酸,50g/L ZnSO4 7H20,10g/L Fe (NH4) 2 (SO4) 2 6H20, 2. 5g/LCuSO4 5H20,0. 5g/L MnSO4 H20,0. 5g/L H3BO3,0. 5g/L Na2MoO4 2H20),pH5. 0 ;或者是包含I %葡萄糖,0. 1-1%蛋白胨,终浓度为0.05M的柠檬酸缓冲液,0.015% Tween 80,0. 14%(NH4)2SO4jO. 2 % KH2PO4,0. 03 % 尿素,0. 04 % CaCl2 2H20,0. 03 % MgSO4 7H20,0. 0005 %FeSO4 *7H20,0. 00016% MnSO4 *H20,0. 00014% ZnSO4 7H20,0. 00037% CoCl2 6H20(MandeIs培养基),pH4. 8-5. 0,以上百分比均为重量百分比。
所述步骤⑷中的诱导物为纸浆废料、微晶纤维素、棉布、脱脂棉、木屑、稻壳、麸皮、秸杆、草和玉米芯的一种或者几种。所述步骤(4)产酶过程中,采用的是间歇分批式、连续培养式或分批补料式的培
养方法。所述步骤(5)得到的粗酶液包括纤维素酶和木聚糖酶。本发明利用培养微生物后的剩余发酵液作为诱导包括里氏木霉、黑曲霉、米曲霉等的丝状真菌生产纤维素酶和木聚糖酶的培养基,培养基原料廉价易得,来源广泛,同时降低了环境污染。实验结果表明,在同等条件下,利用培养微生物后的剩余发酵液作为诱导里氏木霉、黑曲霉和米曲霉产酶的培养基与一般的普通培养基相比,纤维素酶酶活相差不大, 木聚糖酶酶活比一般培养基更高。因此,证实利用培养微生物后的剩余发酵液作为诱导微生物生产纤维素酶和木聚糖酶的培养基是廉价可行的。有益.效果(I)本发明以微生物发酵废液为原料,充分利用了废液中的营养和产酶促进因子,不需加入太多的碳源和氮源,降低了水耗、能耗;(2)本发明既减少了微生物发酵废液排放对环境的污染及其处理成本,又可以大大降低木质纤维素降解酶的生产成本;(3)本发明的发酵培养基与常规培养基相比,产生的纤维素酶活力相差不大,木聚糖酶活力比常规培养基的更高,活力最高达5倍以上;(4)该生产工艺具有原料来源广泛,成本低,可操作性强等优点。


图I是实施例I中纤维素酶活力测定结果;图2是实施例I中木聚糖酶活力测定结果;图3是实施例2中纤维素酶活力测定结果;图4是实施例2中木聚糖酶活力测定结果;图5是实施例3中纤维素酶活力测定结果;图6是实施例3中木聚糖酶活力测定结果;图7是实施例4中纤维素酶活力测定结果;图8是实施例4中木聚糖酶活力测定结果;其中,图I-图8中,( )代表实施例1-4中实验组产生的纤维素酶和木聚糖酶的酶活,(口)代表葡萄糖对照组产生的纤维素酶和木聚糖酶的酶活。
具体实施例方式下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解,在阅读了本发明讲授的内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。实施例II.大肠杆菌发酵废液的制备
将大肠杆菌(Escherichia coli)CVCC 1420接种I环到含I %胰蛋白胨,0. 5%酵母浸膏,1% NaCl,pH7.0的培养基中。在37°C下培养24h后用滤纸将培养基中的一些杂质去除,获得大肠杆菌发酵培养基清液,将其作为诱导里氏木霉菌株产酶的培养基。2.里氏木霉的种子培养(I)里氏木霉种子培养基1%葡萄糖,0. 1%蛋白胨,0.05%柠檬酸,0.015%Tween 80,2% Voger s medium N(125g/L 二水柠檬酸钠,250g/L KH2PO4,100g/L NH4NO3,10g/LMgS04 IW2Q, 250 u g/L 生物素,5g/L CaCl2 2H20,5mL/L 微量元素溶液);其中,微量元素溶液含 50g/L —水柠檬酸,50g/L ZnSO4 IW2Q, 10g/L Fe (NH4) 2 (SO4) 2 6H20, 2. 5g/LCuSO4 5H20,0. 5g/L MnSO4 H20,0. 5g/L H3BO3,0. 5g/L Na2MoO4 2H20 ;(2)以里氏木霉(T.reesei)Rut C30 为生产菌株,在 pH5. 0,30°C,160r/min 条件下培养36h。3.里氏木霉发酵产酶(I)里氏木霉产酶培养基(实验组)大肠杆菌发酵废液IOOmL,补加1%葡萄糖,0. 1%蛋白腺,0. 05%朽1 樣酸,0. 015% Tween 80, 2% Vogel’ s medium N,添加 2%硫酸盐纸浆废料作为诱导物,PH5. 0 ;里氏木霉产酶培养基(对照组)蒸馏水100mL,l%葡萄糖,0. 1%蛋白胨,0.05%朽1檬酸,0. 015% Tween 80, 2% Vogel’ s medium N,添加2%硫酸盐纸衆废料作为诱导物,pH5. 0 ;(2)以10%接种量,在28°C,160r/min条件下培养IOd诱导产酶;过滤或离心收集
的发酵液清液,测定每天所产生的纤维素酶和木聚糖酶酶活。4.纤维素酶活力测定(I)粗酶液中还原糖的测定0. ImL粗酶液+0. 9mL蒸馏水+3mL 3,5- 二硝基水杨酸(DNS),沸水浴5min,冷却后加蒸懼水至25mL, 550nm处测得OD1 ;(2)粗酶液与羧甲基纤维素钠(CMC-Na)反应后总还原糖的测定0. ImL粗酶液+0. 9mLl % CMC-Na溶液(用50mM,pH5. 0的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液配制),50°C水浴IOmin后加入3mLDNS,沸水浴5mn ;冷却后加蒸懼水至25mL, 550nm处测得OD2 ;(3) AOD = OD2-OD1,1个酶活力单位(IU)定义为每分钟水解羧甲基纤维素钠产生
IU mol还原糖(以葡萄糖计)所需的酶量。
权利要求
1.一种利用发酵废液制备生物酶的方法,包括 (1)将微生物在培养基中培养2-10天,分离获得剩余发酵废液; (2)利用上述剩余发酵废液制得生物酶生产菌的发酵培养基; (3)将生物酶生产菌的菌株接种到种子培养基于25-30°C,120-250r/min条件下培养.24-48小时; (4)以5-10%接种量转接至由步骤(2)制得的发酵培养基中产酶,其中加入1-10%诱导物; (5)在25-30°C,120-250r/min条件下培养4_10天,过滤,离心得粗酶液。
2.根据权利要求I所述的一种利用发酵废液制备生物酶的方法,其特征在于所述步骤(I)中的微生物为大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、木醋杆菌或酵母菌。
3.根据权利要求2所述的一种利用发酵废液制备生物酶的方法,其特征在于所述大肠杆菌分离获得剩余发酵废液的具体工艺为将大肠杆菌取1-2环接种到含有I %胰蛋白胨或蛋白胨、0. 5%酵母浸膏、1% NaCl、pH7. 0的培养基中,在37°C下培养24_72h后,用滤器将培养基过滤或高速离心取上清液,获得大肠杆菌发酵废液。
4.根据权利要求2所述的一种利用发酵废液制备生物酶的方法,其特征在于所述金黄色葡萄球菌分离获得剩余发酵废液的具体工艺为将金黄色葡萄球菌取1-2环接种到含有0. 5%胰蛋白胨或蛋白胨、0. 3%牛肉膏、5% NaCl, pH7. 4的培养基中,在37°C下培养.24-72h后,用滤器将培养基过滤或高速离心取上清液,获得金黄色葡萄球菌发酵废液。
5.根据权利要求2所述的一种利用发酵废液制备生物酶的方法,其特征在于所述木醋杆菌分离获得剩余发酵废液的具体工艺为将木醋杆菌取1-2环接种到含有2. 5%葡萄糖、0. 3%胰蛋白胨或蛋白胨、0. 5%酵母提取物、pH4. 0-7. 0的种子培养基中,25_30°C动态培养24h制备种子液,然后按体积百分比3-15 %的接种量转接到发酵培养基中,30°C静置或动态培养7-14天,取出产生的细菌纤维素,获得木醋杆菌发酵废液。
6.根据权利要求2所述的一种利用发酵废液制备生物酶的方法,其特征在于所述酵母菌分离获得剩余发酵废液的具体工艺为将酵母菌取1-2环接种到含有0. 5%胰蛋白胨或蛋白胨、I. 5%酵母浸膏、0. 5%硫酸铵、2%葡萄糖、pH5-6的培养基中,在30°C下培养.24-72h后,用滤器将培养基过滤或高速离心取上清液,获得酵母菌发酵废液。
7.根据权利要求I所述的一种利用发酵废液制备生物酶的方法,其特征在于所述步骤(2)中的生物酶生产菌为里氏木霉、黑曲霉或米曲霉。
8.根据权利要求I所述的一种利用发酵废液制备生物酶的方法,其特征在于所述步骤(2)中的发酵培养基的组分为剩余发酵废液中,补加0-1%葡萄糖,0. 1-1%蛋白胨,.0. 05%柠檬酸,0. 015% Tween 80,2% Vogel’s medium N,pH5. 0 ;或者是补加 0. 1-1%葡萄糖,0. 1-1%蛋白胨,终浓度为0.05M的柠檬酸缓冲液,0.015% Tween 80,0. 14% (NH4)2SO4,.0. 2% KH2PO4,0. 03%尿素,0. 04% CaCl2 2H20,0. 03% MgSO4 7H20,0. 0005% FeSO4 7H20,.0. 00016% MnSO4 H20,0. 00014% ZnSO4 7H20,0. 00037% CoCl2 6H20,以上百分比均为重量百分比。
9.根据权利要求I所述的一种利用发酵废液制备生物酶的方法,其特征在于所述步骤(3)中的种子培养基包含1%葡萄糖,0. 1-1%蛋白胨,0.05%柠檬酸,0.015% Tween.80,2% Voger smedium N,pH5. 0 ;或者是包含I %葡萄糖,0. 1_1 %蛋白胨,终浓度为0. 05M的柠檬酸缓冲液,0. 015% Tween 80,0. 14% (NH4) 2S04,0. 2 % KH2PO4,0. 03% 尿素,0. 04%CaCl2 2H20,0. 03 % MgSO4 7H20,0. 0005 % FeSO4 7H20,0. 00016 % MnSO4 H20,0. 00014 %ZnSO4 7H20,0. 00037% CoCl2 6H20, pH4. 8-5. 0,以上百分比均为重量百分比。
10.根据权利要求I所述的一种利用发酵废液制备生物酶的方法,其特征在于所述步骤(4)中的诱导物为纸浆废料、微晶纤维素、棉布、脱脂棉、木屑、稻壳、麸皮、秸杆、草和玉米芯的一种或者几种。
11.根据权利要求I所述的一种利用发酵废液制备生物酶的方法,其特征在于所述步骤(4)产酶过程中,采用的是间歇分批式、连续培养式或分批补料式的培养方法。
12.根据权利要求I所述的一种利用发酵废液制备生物酶的方法,其特征在于所述步骤(5)得到的粗酶液包括纤维素酶和木聚糖酶。
全文摘要
本发明涉及一种利用发酵废液制备生物酶的方法,包括(1)将微生物在培养基中培养2-10天,分离获得剩余发酵废液;(2)利用上述剩余发酵废液制得生物酶生产菌的发酵培养基;(3)将生物酶生产菌的菌株接种到种子培养基于25-30℃,120-250r/min条件下培养24-48小时;(4)以5-10%接种量转接至发酵培养基中产酶,其中加入1-10%诱导物;(5)在25-30℃,120-250r/min条件下培养4-10天,过滤,离心得粗酶液。本发明既降低了酶制剂的生产成本,也减少了发酵废液对环境带来的危害,有效实现发酵废弃物变废为宝、资源化再利用的低碳减排目的。
文档编号C12R1/685GK102660519SQ20121013433
公开日2012年9月12日 申请日期2012年5月2日 优先权日2012年5月2日
发明者唐敬玉, 洪枫, 郭香, 阮善明 申请人:东华大学

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